滅菌法系指用適當?shù)奈锢砘蚧瘜W手段將物品中活的微生物殺滅或除去，從而使物品殘存活微生物的概率下降**預期的無菌保證水平的方法。本法適用于制劑、原料、輔料及醫(yī)療器械等物品的滅菌。
無菌物品是指物品中不含任何活的微生物。對于任何一批滅菌物品而言，**無菌無法保證，也無法用試驗來證實。一批物品的無菌特性只能相對地通過物品中活微生物的概率低**某個可接受的水平來表述，即無菌保證水平(Sterility assurance level，簡稱SAL)。實際生產(chǎn)過程中，滅菌是指將物品中污染微生物的概率下降**預期的無菌保證水平。**終滅菌的物品微生物存活概率，即無菌保證水平不得高于10^－6。已滅菌物品達到的無菌保證水平可通過驗證確定。
滅菌物品的無菌保證不能依賴于**終產(chǎn)品的無菌檢驗，而是取決于生產(chǎn)過程中采用合格的滅菌工藝、嚴格的GMP管理和良好的無菌保證體系。滅菌工藝的確定應綜合考慮被滅菌物品的性質(zhì)、滅菌方法的有效性和經(jīng)濟性、滅菌后物品的完整性和穩(wěn)定性等因素。
滅菌程序的驗證是無菌保證的必要條件。滅菌程序經(jīng)驗證后，方可交付正式使用。驗證內(nèi)容包括：
(1)撰寫驗證方案及制定評估標準。
(2)確認滅菌設備技術資料齊全、安裝正確，并能處于正常運行(安裝確認)。
(3)確認滅菌設備、關鍵控制和記錄系統(tǒng)能在規(guī)定的參數(shù)范圍內(nèi)正常運行(運行確認)。
(4)采用被滅菌物品或模擬物品按預定滅菌程序進行重復試驗，確認各關鍵工藝與參數(shù)符合預定標準，確定經(jīng)滅菌物品的無菌保證水平符合規(guī)定(性能確認)。
(5)匯總并完善各種文件和汜錄，撰寫驗證報告。
日常生產(chǎn)中，應對滅菌程序的運行情況進行監(jiān)控，確認關鍵參數(shù)(如溫度、壓力、時間、濕度、滅菌氣體濃度及吸收的輻照劑量等)均在驗證確定的范圍內(nèi)。滅菌程序應定期進行再驗證。當滅菌設備或程序發(fā)生變更(包括滅菌物品裝載方式和數(shù)量的改變)時，應進行再驗證。
物品的無菌保證與滅菌工藝、滅菌前物品被污染的程度及污染菌的特性相關。因此，應根據(jù)滅菌工藝的特點制定滅菌物品滅菌前的微生物污染水平及污染菌的耐受限度并進行監(jiān)控，并在生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)采取各種措施降低污染，確保微生物污染控制在規(guī)定的限度內(nèi)。
滅菌的冷卻階段。應采取措施防止已滅菌物品被再次污染。任何情況下，都應要求容器及其密封系統(tǒng)確保物品在有效期內(nèi)符合無菌要求。
滅菌方法
常用的滅菌方法有濕熱滅菌法、干熱滅菌法、輻射滅菌法、氣體滅菌法和過濾除菌法。可根據(jù)被滅菌物品的特性采用一種或多種方法組合滅菌。只要物品允許，應盡可能選用**終滅菌法滅菌。若物品不適合采用**終滅菌法，可選用過濾除菌法或無菌生產(chǎn)工藝達到無菌保證要求，只要可能，應對非**終滅菌的物品作補充性滅菌處理(如流通蒸汽滅菌)。
一、濕熱滅菌法
本法系指將物品置于滅菌柜內(nèi)利用高壓飽和蒸汽，過熱水噴淋等手段使微生物菌體中的蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生變性而殺滅微生物的方法。該法滅菌能力強．為熱力滅菌中**有效、應用**廣泛的滅菌方法。藥品、容器、培養(yǎng)基、無菌衣、膠塞以及其他遇高溫和潮濕不發(fā)生變化或損壞的物品。均可采用本法滅菌。流通蒸汽不能完全殺滅細菌孢子，一般可作為不耐熱無菌產(chǎn)品的輔助滅菌手段。
濕熱滅菌條件的選擇應考慮滅菌物品的熱穩(wěn)定性、熱穿透力、微生物污染程度等因素。濕熱滅菌條件通常采用121℃×15min、121℃×30min或116℃×40min的程序，也可采用其他溫度和時間參數(shù)，但無論采用何種滅菌溫度和時間參數(shù)，都必須證明所采用的滅菌工藝和監(jiān)控措施在正常運行過程中能確保物品滅菌后的SAL≤10^－6。當滅菌程序的選定采用F₀值概念時(F₀值為標準滅菌時間，系滅菌過程賦予被滅菌物品121℃下的滅菌時間)，應采取特別措施確保被滅菌物品能得到足夠的無菌保證，此時，除對滅菌程序進行驗證外，還必須在生產(chǎn)過程中對微生物進行監(jiān)控，證明污染的微生物指標低于設定的限度。對熱穩(wěn)定的物品，滅菌工藝可**過度殺滅法，以保證被滅菌物品獲得足夠的無菌保證值。熱不穩(wěn)定性物品，其滅菌工藝的確定依賴于在一定的時間內(nèi)，一定的生產(chǎn)批次的被滅菌物品滅菌前微生物污染的水平及其耐熱性。因此，日常生產(chǎn)全過程應對產(chǎn)品中污染的微生物進行連續(xù)地、嚴格地監(jiān)控．并采取各種措施降低物品微生物污染水平，特別是防止耐熱菌的污染。熱不穩(wěn)定性物品的F₀值一般不低干8min。
采用濕熱滅菌時，被滅菌物品應有適當?shù)难b載方式，不能排列過密，以保證滅菌的有效性和均一性。
濕熱滅菌法應確認滅菌柜在不同裝載時可能存在的冷點。當用生物指示劑進一步確認滅菌效果時，應將其置于冷點處。水法常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus)。
二、干熱滅菌法
本法系指將物品置于干熱滅菌柜、隧道滅菌器等設備中，利用干熱空氣達到殺滅微生物或消除熱原物質(zhì)的方法。適用于耐高溫但不宜用濕熱滅菌法滅菌的物品滅菌，如玻璃器具、金屬制容器、纖維制品、固體試藥、液狀石蠟等均可采用本法滅菌。
干熱火菌條件一般為160～170℃×120min以上、170～l80℃×60min以上或250℃×45min以上，也可采用其他溫度和時間參數(shù)。無論采用何種滅菌條件，均應保證滅菌后的物品的SAL≤10#p#分頁標題#e#^－6。采用干熱過度殺滅后的物品一般無需進行滅菌前污染微生物的測定。250℃×45min的干熱滅菌也可除去無菌產(chǎn)品包裝容器及有關生產(chǎn)灌裝用具中的熱原物質(zhì)。
采州干熱滅菌時，被滅菌物品應有適當?shù)难b載方式，不能排列過密，以保證滅菌的有效性和均一性。
干熱滅菌法應確認滅菌柜中的溫度分布符合設定的標準及確定**冷點位置等。常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)。細菌內(nèi)毒素滅活驗證試驗是證明除熱原過程有效性的試驗。一般將不小于1000單位的細菌內(nèi)毒素加入待去熱原的物品中，證明該去熱原工藝能使內(nèi)毒素**少下降3個對數(shù)單位。細菌內(nèi)毒素滅活驗證試驗所用的細菌內(nèi)毒素一般為大腸埃希菌內(nèi)毒素(Escherichia coliendoxin)。
三、輻射滅菌法
本法系指將物品置于適宜放射源輻射的γ射線或適宜的電子加速器發(fā)生的電子束中進行電離輻射而達到殺滅微生物的方法。本法**常用的為⁶⁰Co-γ射線輻射滅菌。醫(yī)療器械、容器、生產(chǎn)輔助用品、不受輻射破壞的原料藥及成品等均可用本法滅菌。
采用輻射滅菌法滅菌的無菌物品其SAL應≤10^－6。γ射線輻射滅菌所控制的參數(shù)主要是輻射劑量(指滅菌物品的吸收劑量)。泫劑量的制定應考慮滅菌物品的適應性及可能污染的微生物**大數(shù)量及**強抗輻射力，事先應驗證所使用的劑量不影響被滅菌物品的安全性、有效性及穩(wěn)定性。常用的輻射滅菌吸收劑量為25kGy。對**終產(chǎn)品，原料藥、某些醫(yī)療器材應盡可能采用低輻射劑量滅菌。滅菌前，應對被滅菌物品微生物污染的數(shù)量和抗輻射強度進行測定，以評價滅菌過程賦予該滅菌物品的無菌保證水平。對于已設定的劑量，應定期審核，以驗證其有效性。
滅菌時，應采用適當?shù)幕瘜W或物理方法對滅菌物品吸收的輻射劑量進行監(jiān)控。以充分證實滅菌物品吸收的劑量是在規(guī)定的限度內(nèi)。如采用與滅菌物品一起被輻射的放射性劑量計，劑量計要置于規(guī)定的部位。在初安裝時劑量計應用標準源進行校正，并定期進行再校正。
⁶⁰Co-γ射線輻射滅菌法常用的生物指示劑為短小芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus pumilus)。
四、氣體滅菌法
本法系指用化學消毒劑形成的氣體殺滅微生物的方法。常用的化學消毒劑有環(huán)氧乙烷、氣態(tài)過氧化氫、甲醛、臭氧(O₃)等，本法適用于在氣體中穩(wěn)定的物品滅菌。采用氣體滅菌法時，應注意滅菌氣體的可燃可爆性、致畸性和殘留毒性。
本法中**常用的氣體是環(huán)氧乙烷，一般與80％～90％的惰性氣體混合使用，在充有滅菌氣體的高壓腔室內(nèi)進行。該法可用于醫(yī)療器械，塑料制品等不能采用高溫滅菌的物品滅菌。含氯的物品及能吸附環(huán)氧乙烷的物品則不宜使用本法滅菌。
采用環(huán)氧乙烷滅菌時，滅菌柜內(nèi)的溫度、濕度、滅菌氣體濃度、滅菌時間是影響滅菌效果的重要因數(shù)。可采用下列滅菌條件：
    溫度              54℃±10℃
    相對濕度          60％±10％
    滅菌壓力          8×10⁵Pa
    滅菌時間          90min
滅菌條件應予驗證。滅菌時，將滅菌腔室抽成真空，然后通入蒸汽使腔室內(nèi)達到設定的溫濕度平衡的額定值，再通入經(jīng)過濾和預熱的環(huán)氧乙烷氣體。滅菌過程中，應嚴密監(jiān)控腔室的溫度、濕度、壓力、環(huán)氧乙烷濃度及滅菌時間。必要時使用生物指示劑監(jiān)控滅菌效果。本法滅菌程序的控制具有一定難度，整個滅菌過程應在技術熟練人員的監(jiān)督下進行。滅菌后，應采取新鮮空氣置換，使殘留環(huán)氧乙烷和其他易揮發(fā)性殘留物消散。并對滅菌物品中的環(huán)氧乙烷殘留物和反應產(chǎn)物進行監(jiān)控，以證明其不超過規(guī)定的濃度，避免產(chǎn)生毒性。    ·
采用環(huán)氧乙烷滅菌時，應進行泄漏試驗，以確認滅菌腔室的密閉性。滅菌程序確認時，還應考慮物品包裝材料和滅菌腔室巾物品的排列方式對滅菌氣體的擴散和滲透的影響。生物指示劑一般采用枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)。
五、過濾除菌法
本法系利用細菌不能通過致密具孔濾材的原理以除去氣體或液體中微生物的方法。常用于氣體、熱不穩(wěn)定的藥品溶液或原料的除菌。
除菌過濾器采用于孔徑分布均勻的微孔濾膜作過濾材料，微孔濾膜分親水性和疏水性兩種。濾膜材質(zhì)依過濾物品的性質(zhì)及過濾目的而定。約品牛產(chǎn)十采用的除菌濾膜孔徑一般不超過0.22μm。過濾器的孔徑定義來自過濾器對微生物的截留，而非平均孔徑的分布系數(shù)。所以，用于**終除菌的過濾器必須選擇具有截流實驗證明的除菌級過濾器。過濾器對濾液的吸附不得影響藥品質(zhì)量，不得有纖維脫落，禁用含石棉的過濾器。過濾器的使用者應了解濾液過濾過程中的析出物性質(zhì)、數(shù)量并評估其毒性影響。濾器和濾膜在使用前應進行潔凈處理，并用高壓蒸汽進行滅菌或作在線滅菌。更換品種和批次應先清洗濾器，再更換濾芯或濾膜或直接更換濾器。
過濾過程中無菌保證與過濾液體的初始生物負荷及過濾器的對數(shù)下降值LRV(log reduction value)有關。LRV系指規(guī)定條件下．被過濾液體過濾前的微生物數(shù)量與過濾后的微生物數(shù)量比的常用對數(shù)值。#p#分頁標題#e#
即：    LRV=lgN₀－lgN
式中   N₀為產(chǎn)品除菌前的微生物數(shù)量。
       N為產(chǎn)品除菌后的微生物數(shù)量。
LRV用于表示過濾器的過濾除菌效率，對孔徑為0.22μm的過濾器而言，要求每1cm²有效過濾面積的LRV應不小于7。因此過濾除菌時，被過濾產(chǎn)品總的污染量應控  制在規(guī)定的限度內(nèi)。為保證過濾除菌效果，可使用兩個除菌級的過濾器串連過濾，或在灌裝前用過濾器進行再次過濾。
在過濾除菌中，一般無法對全過程中過濾器的關鍵參數(shù)(濾膜孔徑的大小及分布，濾膜的完整性及LRV)進行監(jiān)控。因此，在每一次過濾除菌前后均應作濾器的完整性試驗，即氣泡點試驗或壓力維持試驗或氣體擴散流量試驗，確認濾膜在除菌過濾過程中的有效性和完整性。完整性的測試標準來自于相關細菌載留實驗數(shù)據(jù)。除菌過濾器的使用時間應進行驗證，一般不應超過一個工作日，否則應進行驗證。
過濾除菌法常用的生物指示劑為缺陷假單胞菌(Pseudomonas diminuta)。
通過過濾除菌法達到無菌的產(chǎn)品應嚴密臨控其生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度，應在無菌環(huán)境下進行過濾操作。相關的設備、包裝容器、塞子及其他物品應采用適當?shù)姆椒ㄟM行滅菌，并防止再污染。
六、無菌生產(chǎn)工藝
無菌生產(chǎn)工藝系指必須在無菌控制條件下生產(chǎn)無菌制劑的方法，無菌分裝及無菌凍干是**常見的無菌生產(chǎn)工藝。后者在工藝過程中須采用過濾除菌法。
無菌生產(chǎn)工藝應嚴密監(jiān)控其生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度，并應在無菌控制的環(huán)境下進行過濾操作。相關的設備、包裝容器、塞子及其他物品應采用適當?shù)姆椒ㄟM行滅菌。并防止被再次污染。
無菌生產(chǎn)工藝過程的無菌保證應通過培養(yǎng)基無菌灌裝模擬試驗驗證。在生產(chǎn)過程中，應嚴密監(jiān)控生產(chǎn)環(huán)境的無菌空氣質(zhì)量、操作人員的素質(zhì)、各物品的無菌性。
無菌生產(chǎn)工藝應定期進行驗證．包括對環(huán)境空氣過濾系統(tǒng)有效性驗證及培養(yǎng)基模擬灌裝試驗。
生物指示劑
生物指示劑系一類特殊的活微生物制品，可用于確認滅菌設備的性能、滅菌程序的驗證、生產(chǎn)過程滅菌效果的監(jiān)控等。用于滅菌驗證中的生物指示劑一般是細菌的孢子。
1．制備生物指示劑用微生物的基本要求
不同的滅菌方法使用不同的生物指示劑，制備生物指示劑所選用的微生物必須具備以下特性：
(1)菌種的耐受性應大于需滅菌產(chǎn)品中所有可能污染菌的耐受性。
(2)菌種應無致病性。
(3)菌株應穩(wěn)定。存活期長，易于保存。
(4)易于培養(yǎng)。若使用休眠孢子，生物指示劑中休眠孢子含量要在90％以上。
2．生物指示劑的制備
生物指示劑的制備應按一定的程序進行，制備前，需先確定所用微生物的特性，如D值(微生物的耐熱參數(shù)，系指一定溫度下，將微生物殺滅90％所需的時間，以分鐘表示)等。菌株應用適官的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)物應制成懸浮液，其中孢子的數(shù)量應占優(yōu)勢，孢子應懸浮于無營養(yǎng)的液體中保存。
生物指示劑中包含一定數(shù)量的一種或多種孢子。可制成多種形式。通常是將一定數(shù)量的孢子附著在惰性的載體上，如濾紙條、玻片、不銹鋼、塑料制品等：孢子懸浮液也可密封于安瓿中；有的生物指示劑還配有培養(yǎng)基系統(tǒng)。D值除與滅菌條件相關外，還與微生物存在的環(huán)境有關。因此，一定形式的生物指示劑制備完成后，應測定D值和孢子總數(shù)。生物指示劑應選用合適的材料包裝，并設定有效期。載體和包裝材料在保護生物指示劑不致污染的同時，還應保證滅菌劑穿透并能與生物指示劑充分接觸。載體和包裝的設計·原則是便于貯存、運輸、取樣、轉(zhuǎn)移接種。
有些生物指示劑可直接將孢子接種**液體滅菌物或具有與其相似的物理和化學特性的替代品中。使用替代品時，應用數(shù)據(jù)證明二者的等效性。
3．生物指示劑的應用
在滅菌程序的驗證中，盡管可通過滅菌過程某些參數(shù)的監(jiān)控來評估滅菌效果，但生物指示劑的被殺滅程度，則是評價一個滅菌程序有效性**直觀的指標。可使用市售的標    準生物指示劑，也可使用由日常生產(chǎn)污染菌監(jiān)控中分離耐受性**強的微生物制備的孢子。在生物指示劑驗證試驗中，需確定孢子在實際滅菌條件下的D值，并測定孢子的純度和數(shù)量。驗證時，生物指示劑的微生物用量應比日常檢出的微生物污染量大，耐受性強，以保證滅菌程序有更大的安全性。在**終滅菌法中，生物指示劑應放任滅菌柜的不同部位。并避免指示劑直接接觸到被滅菌物品。生物指示劑按設定的條件滅菌后取出，分別置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，確定生物指示劑中的孢子是否被完全殺滅。
過度殺滅產(chǎn)品滅菌驗證一般不考慮微生物污染水平，可采用市售的生物指示劑。對滅菌手段耐受性差的產(chǎn)品，設計滅菌程序時，根據(jù)經(jīng)驗預計在該生產(chǎn)工藝中產(chǎn)品微生物污染的水平，選擇生物指示劑的菌種和孢子數(shù)量。這類產(chǎn)品的無菌保證應通過監(jiān)控每批滅菌前的微生物污染的數(shù)量、耐受性和滅菌程序驗證所獲得的數(shù)據(jù)進行評估。
4．常用生物指示劑
(1)濕熱滅菌法  濕熱滅菌法**常用的牛物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(Spores of #p#分頁標題#e#Bacillus stearothermophilus，如NCTC 10007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。D值為1.5～  3.0min，每片(或每瓶)活孢子數(shù)5×10⁵～5×10⁶個，在121℃、19min下應被完全殺滅。此外，還可使用生孢梭菌孢子(Spores of Clostridium sporogenes，如NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955)，D值為0.4～0.8min。
(2)干熱滅菌法  干熱滅菌法**常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌抱子(Spores of Bacillus subtilis，如NCIMB 8058、ATCC 9372)。D值大于1.5min，每片活孢子數(shù)5×10⁵～5×10⁶個。去熱原驗證時使用大腸埃希菌內(nèi)毒素(Escherichia coliendomn)，加量不小于1000細菌內(nèi)毒索單位。
(3)輻射滅菌法  輻射滅菌法**常用的生物指示劑為短小芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus pumilus，如NCTC 10327、NCIMB 10692、ATCC 27142)。每片活抱子數(shù)10⁷～10⁸，置于放射劑量25kGy條件下，D值約3kGy。但應注意滅菌物品中所負載的微生物可能比短小芽孢桿菌孢子顯示更強的抗輻射力。因此短小芽孢桿菌孢子可用于監(jiān)控滅菌過程，但不能用于滅菌輻射劑量建立的依據(jù)。
(4)氣體滅菌法  環(huán)氧乙烷滅菌**常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus subtilis，如NCTC 10073、ATCC 9372)。氣態(tài)過氧化氫滅菌**常用的生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(Spores of Bacillus steatothermophilus，如NCTC 10007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。每片活孢子數(shù)1×10⁶～5×10⁶個。環(huán)氧乙烷滅菌中，枯草芽孢桿菌孢子D值大于2.5min，在環(huán)氧乙烷濃度為600mg／L，相對濕度為60％，溫度為54℃下滅菌，60min應被殺滅。
(5)過濾除菌法  過濾除菌法**常用的生物指示劑為缺陷假單胞菌(Pseudomonas diminuta，如ATCC 19146)，用于濾膜孔徑為0.22μm的濾器；黏質(zhì)沙雷菌(Serratia  marcescens)(ATCC 1 4756)用于濾膜孔徑為0.45μm的濾器。